Europa, 1500, vroege Renaissance. Maximiliaan I, Keizer van Oostenrijk, voert oorlog met Frankrijk en het Ottomaanse rijk. Zijn dochter Margaretha dient als pion voor zijn politieke strategieën. Wanneer Margaretha de leeftijd van 27 jaar bereikt is ze al drie keer getrouwd en staat ze op het punt om regentes te worden van haar neefje Karel V.
De Nacht van Margaretha vertelt het verhaal van een vrouw, gevangen tussen familiebelangen en haar zoektocht naar individuele vrijheid. Een monoloog over het gevecht dat een vrouw voert die zelf nooit keuzes heeft kunnen maken. Maar ook hoe ze vanuit haar beperkingen haar mogelijkheden realiseert.